Mario og Peach ankommer på Delfino Island, hvor ikke alt er som de forventer. En ond udgave af Mario, Shadow Mario, har gjort hærværk på øen, og øens beboere beskylder Mario for dette. Mario skal nu gøre hele byen ren med sin nye ven F.L.U.D.D og finde ud af, hvem og hvad der har gjort dette. Endnu engang bliver Peach taget, men denne gang af den mystiske Shadow Mario.